血清分離實(shí)驗(yàn)?zāi)哪苌俚牧怂?/h3>
離心機(jī)被廣泛應(yīng)用于血清分離實(shí)驗(yàn)。
血清蛋白主要由清蛋白和球蛋白組成,各行使其重要的功能。
血液完全凝固和離心條件是至關(guān)重要的兩個(gè)環(huán)節(jié),離心要求采用水平式離心機(jī)。具體操作步驟是:采血后立即輕輕倒轉(zhuǎn)采血試管4~5次混勻標(biāo)本,等待標(biāo)本充分凝固需要放置30min,離心半徑200px,離心機(jī)離心速度維持在3500~4000r/min離心10min。血清與血凝塊完全被分離膠分離,血清標(biāo)本可直接上機(jī)檢測或轉(zhuǎn)移至儀器配套試杯中。具備這個(gè)條件才能制備出高品質(zhì)血清標(biāo)本,說明分離膠效果好。
鹽析后蛋白質(zhì)沉淀經(jīng)水溶后,特點(diǎn)是保持蛋白質(zhì)生物學(xué)活性,因此,鹽析法是研究蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)和功能的最常用方法。除鹽析法,有機(jī)溶劑沉淀法、等電點(diǎn)沉淀法、柱層析法和超速離心法等也是蛋白質(zhì)分離的常用方法。
實(shí)驗(yàn)器材和試劑
1.器材:10ml具塞刻度試管、離心機(jī)、離心管、小試管、5ml吸管、滴管2支、培養(yǎng)皿3套、醋酸纖維薄膜、點(diǎn)樣器、電泳槽、電泳儀、1.0×20cm層析柱。
2.試劑:
(1) 葡聚糖凝膠Sephadex G-25:稱10g SephadexG-25,加200ml 0.02mol/L pH6.5磷酸鹽緩沖液溶脹24小時(shí)。
(2) 生理鹽水:稱取分析純NaCl 0.89g,蒸餾水稀釋至100ml。
(3) 飽和硫酸銨溶液:25℃時(shí)稱取(NH4)2SO4約767g,溶解至1000ml蒸餾水中,至不能完全溶解為止,即為飽和硫酸銨溶液。
(4) 巴比妥緩沖液(pH 8.6):稱取巴比妥鈉15.458g.巴比妥2.768g,蒸餾水定容至1000m1。
(5) 氨基黑10B染色液:稱取氨基黑10B 0.5g,加入100ml漂洗液不斷振搖,直到完全溶解。
(6) 漂洗液:取95%乙醇450ml,冰醋酸100m1,混勻后,用蒸餾水稀釋到l000ml。
鹽析沉淀蛋白質(zhì):
取10 m1具塞刻度試管1支,加入血清溶液 2.5ml,緩慢加進(jìn)等量飽和(NH4)2SO4溶液,充分搖勻,見有沉淀析出,靜置10min,用雙層濾紙過濾,棄去沉淀,取濾液。
蛋白質(zhì)分子能穩(wěn)定存在于水溶液中是因?yàn)橛袃蓚€(gè)穩(wěn)定因素:水化膜和表面電荷。當(dāng)維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定因素破壞時(shí),蛋白質(zhì)分子可相互聚集沉淀而析出,蛋白質(zhì)分子沉淀析出的方法很多,根據(jù)對蛋白質(zhì)穩(wěn)定因素破壞的不同有中性鹽析法、有機(jī)溶溶劑法、重金屬鹽法以及生物堿試劑法等。鹽析法是以中性鹽如硫酸銨((NH4)2SO4)等對蛋白質(zhì)作用破壞蛋白質(zhì)表面水化膜而使蛋白質(zhì)相互聚集而析出。不同的蛋白質(zhì)沉淀需要的中性鹽濃度不同,在不同鹽濃度下,蛋白質(zhì)溶解度不同。球蛋白在半飽和狀態(tài)下發(fā)生沉淀,而請蛋白在完全飽和狀態(tài)下沉淀,利用此特性可把蛋白質(zhì)分段沉淀下來,此種鹽析法稱分段鹽析。
此次實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng):
1、只有經(jīng)過嚴(yán)格培訓(xùn)的人員才能進(jìn)行離心機(jī)操作。
2、操作時(shí)應(yīng)戴手套以及眼睛和黏膜的保護(hù)裝置。
3、規(guī)范的實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)可以避免或盡量減少噴濺和氣溶膠的產(chǎn)生。血液和血清應(yīng)當(dāng)小心吸取,而不能傾倒。嚴(yán)禁用口吸液。
4、移液管使用后應(yīng)完全浸入適當(dāng)?shù)南疽褐小R埔汗軕?yīng)在消毒液中浸泡適當(dāng)?shù)臅r(shí)間,然后再丟棄或滅菌清洗后重復(fù)使用。
5、帶有血凝塊等的廢棄標(biāo)本管,在加蓋后應(yīng)當(dāng)放在適當(dāng)?shù)姆缆┤萜鲀?nèi)高壓滅菌和/或焚燒。
6、應(yīng)備有適當(dāng)?shù)南緞﹣砬逑磭姙R和溢出標(biāo)本。
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