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矛尾復蝦虎魚病原哈氏弧菌的鑒定及特異性檢測方法的研究

摘 要：2009 年 8 至 9 月間，江蘇贛榆縣多家蝦蟹養殖塘混養的矛尾復蝦虎魚大量死亡，主要病變特征為體表出血、肌肉潰瘍，從矛尾復蝦虎魚深層潰爛組織及肝臟中分離出優勢菌，通過感染實驗表明了該菌對矛尾復蝦虎魚有很強的致病性，當分離菌濃度在 106 至 108 可引起矛尾復蝦虎魚全部死亡。對分離菌進行相關的形態及理化特性等生物學特性檢驗，分析了 16S rRNA 和 gyrB 兩種基因序列的同源性，并采用 PAUP4.0 的最大簡約法maximum parsimony，MP構建了基于兩種基因的 MP 系統發生樹，結果表明引起矛尾復蝦虎魚大量死亡的病原為弧菌屬Vibrio的哈氏弧菌Vibrio harveyi。同時基于 gyrB 基因和 toxR 基因序列各設計了 1 對特異性引物，接著利用該兩對引物進行 PCR 擴增和敏感性檢測，最后進行海產品的檢驗，建立了一種哈氏弧菌快速、 在 敏感的 PCR 檢測方法。 PCR擴增中，gyrB 基因引物 A2B3 擴增目的片段大小為為 363bp，該方法最低能檢測0.0046875ng/μL 哈氏弧菌模板 DNA；toxR 基因引物 vh-tox-F、vh-tox-R 擴增目的片段大小為為 390bp，該方法最低能檢測 0.75ng/μL 哈氏弧菌模板 DNA。基于哈氏弧菌的 gyrB 基因和 toxR 基因建立的 PCR 檢測技術在對由哈氏弧菌所引起的流行病的調查具有重要意義。

    矛尾復蝦虎魚（Synechogobius hasta）分類于鱸形目（Perciformes）、蝦虎魚科（Gobiidae）、復蝦虎魚屬，俗稱胖頭魚、海鲇魚、扔巴魚，暖溫性中小型底層雜食性魚類，耐溫性和耐鹽性超強。矛尾復蝦虎魚體延長，前部亞圓柱形，尾部側扁。它的頭大，略扁平狀；吻中長，圓鈍；口裂大，下頜微突出，齒小而細密；眼小，上側位，眼間隔寬平；體被圓鱗，尾部鱗大；背鰭兩個，相互分離；復鰭發育成吸盤狀，能固定于海床上，尾鰭尖長。它的體表黃褐色，有不規則暗淡斑紋，體色隨棲息環境不同有所差異；腹部色淺，性成熟期呈淡黃色，復鰭泛紅。一般個體體長 25cm-30 cm，尾重 150g-200g，最大個體長可達 50cm 以上，尾重超過 500g。它們為暖溫性大型蝦虎魚類的一種，分布于我國渤海、東海和朝鮮、日本沿岸及河口附近泥質海區。它們以沙蠶、白蝦、鼓蝦和大眼蟹為主食亦攝食小型蝦虎魚、青鱗等仔、稚魚

1。近年來隨著養殖業的發展，養殖矛尾復蝦虎魚戶逐漸增多，由于多種原因的共同影響，如藥物的濫用，底質逐步老化，水域生態環境日趨惡化，加上管理措施不當，使得魚病不斷爆發。病魚表現為身體發黃發瘦，彎曲成弓形，體表有大小不一的潰爛面，腸道內化膿結節，許多內部器官也發生肉眼可見的病變2。魚病引起的魚的死亡率達 70％以上，這給養殖戶帶來了不可挽回的經濟損失。 2009 年 8 至 9 月間，江蘇連云港贛榆縣多家蝦蟹養殖塘混養的矛尾復蝦虎魚大量死亡，主要病變特征為體表出血，肌肉潰瘍。我們從矛尾復蝦虎魚中深層潰爛組織及肝臟中分離到一種優勢生長菌，然后對其進行生理生化和分子學鑒定，分析了 16S rRNA 和 gyrB 兩種基因序列的同源性，并采用 PAUP4.0 的最大簡約法maximum parsimony，MP構建了基于兩種基因的 MP 系統發生樹，結果表 明 引起矛尾復蝦虎魚大量死亡的病原為弧菌屬Vibrio的哈氏弧菌Vibrioharveyi Johnson and Shunk 1936；同時，以哈氏弧菌 gyrB 基因和 toxR 基因設計特異性引物，進行 PCR 檢測和敏感性試驗，建立哈氏弧菌特異性分子生物學檢測方法。

2 材料和試劑2.1 儀器與設備 儀器：數碼顯微鏡，型號為 DMD5-5，生產廠家為日本尼康公司；電泳儀型號為 DYY-2C，生產廠家為北京市六一儀器；水平凝膠電泳槽型號為 DYCP-31BN，生產廠家為北京市六一儀器廠；常規 PCR 擴增儀型號為 TGradient，生產廠家為德國 Biometra 公司雙人單面凈化工作臺型號為 SW-CJ-2FD，生產廠家為蘇州凈化微波爐型號為 P7021TP-6，生產廠家為中國 Galanz；立式壓力蒸汽滅菌器筒，型號為 01J203-04，生產廠家上海東亞壓力容器制造有限公司；恒溫搖床，型號為 QYC 2102C，生產廠家為上海福瑪實驗設備有限公司；電子天平，型號為 EL104，生產廠家為梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；冷藏冷凍箱，型號為 BCD-206TDZA，生產廠家為青島海爾股份有限公司；生化培養箱，型號為 SPX-250B-Z 型，生產廠家為上海博迅實業有限公司醫療設備廠；臺式高速離心機，型號為 TG16A-WS，生產廠家為上海盧湘離心機儀器有限公司

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