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質(zhì)粒DNA提取不管小提大提都離不開它

發(fā)布時(shí)間:2020-12-9 17:48:12??????點(diǎn)擊:

  離心機(jī)在質(zhì)粒DNA提取中有著很重要的地位,而且操作流程復(fù)雜。

  因?yàn)橘|(zhì)粒DNA作為基因重組與基因轉(zhuǎn)移的載體,在遺傳工程研究中很重要。

  所以在日常的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常會(huì)用到質(zhì)粒DNA,現(xiàn)在都用劑盒非常方便,而且菌體培養(yǎng)后,可以多管濃縮提取,提到的質(zhì)粒量多,可以-20℃保存,以后用于酶切、轉(zhuǎn)化等實(shí)驗(yàn),可以提前跑個(gè)膠,只要不降解,就可以繼續(xù)用,避免每次要用,都要培養(yǎng)一遍再提取一遍。

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  質(zhì)粒DNA常見的提取方式分為兩種:

  一.質(zhì)粒小提

  將之前準(zhǔn)備的LB液體培養(yǎng)基中加入抗性(氨芐1:1000),取15ml 離心管,加入5ml 已加入抗性的液體培養(yǎng)基。

  用小白Tips從平板中挑選單克隆,將小槍頭打入15ml 離心管中,30℃,180rpm,搖 >5h,以看到液體培養(yǎng)基變渾濁為準(zhǔn)。

  取干凈的1.5ml EP管,從15ml 離心管中吸取1.5ml(這個(gè)量可根據(jù)菌液混濁程度加減)菌液,離心機(jī)12000rpm,離心3min。

  棄上清,加入250ul TIANGEN質(zhì)粒小提Kits(Cat# DP103-03,Lot# 6123)P1液,震蕩,徹底混勻。

  加入250ul P2液,溫和(以免DNA斷裂)翻轉(zhuǎn)6-8次,使菌體充分裂解。(這一步總時(shí)間不要超過5min,防止過度裂解,質(zhì)粒受到破壞)

  向EP管中加入350ul P3液,立即溫和上下翻轉(zhuǎn)6-8次,充分混勻,此時(shí)可看到白色絮狀沉淀,離心機(jī)12000rpm,離心3min。(P3加入后應(yīng)立即混勻,避免產(chǎn)生局部沉淀,若上清中還有微小白色沉淀,可再次離心后取上清)

  將吸附柱CP3(實(shí)驗(yàn)前用平衡液BL處理吸附柱可最大限度激活硅基質(zhì)膜,提高得率;BL處理過的吸附柱最好當(dāng)天使用,放置時(shí)間過長會(huì)影響效果)放在收集管中,將上清轉(zhuǎn)移到吸附柱CP3中,盡量不要吸到沉淀,離心機(jī)12000rpm,離心30-60s,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱放入收集管。

  可選步驟:向CP3中加入500ul去蛋白液PD,12000rpm,離心30-60s,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱放入收集管。(如果宿主菌是end A+ 宿主菌TG1、BL21、HB101、JM系列、ET12567等,因其含有大量核酸酶,所以推薦此步驟;若為end A- 宿主菌DH5α、TOP10等,可省略此步)

  向CP3中加入600ul 漂洗液PW(已加入無水乙醇),12000rpm,離心30-60s,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱放入收集管。

  重復(fù)步驟9。

  離心機(jī)12000rpm,離心2min,目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去掉。

  將CP3吸附柱放入一個(gè)干凈的1.5ml EP管中,向吸附膜的中間部位滴加50-100ul洗脫液EB,室溫放置2min,12000rpm,離心2min,將質(zhì)粒溶液收集到EP管中。(為增加質(zhì)粒得率,可將溶液再次加入吸附柱CP3,室溫放置2min,12000rpm,離心2min,將質(zhì)粒溶液收集到EP管中;也可以提前65-70℃預(yù)熱EB液)

  測(cè)濃度,跑膠看提取質(zhì)粒的質(zhì)量。

  二.質(zhì)粒大提,操作這一步前一般要質(zhì)粒小提確認(rèn)質(zhì)粒的質(zhì)量。

  取潔凈的錐形瓶,加入小提步驟1中的LB液體培養(yǎng)基100ml,取小提步驟2中的菌液10ul 加入錐形瓶中,30℃,180rpm,搖過夜,以看到液體培養(yǎng)基變渾濁為準(zhǔn)。

  保存菌種:用15%的甘油保存菌種:1.5ml EP管中加入350ul 菌液+150ul 50%甘,混勻,-80℃保存。

  將錐形瓶中剩下的菌液用50ml 離心管,4℃,8000rpm,離心5min,收集菌體沉淀,可同管多次。

  根據(jù)所選大提試劑盒的說明書按步驟提取,不同試劑盒步驟不一樣。

  提取結(jié)束后測(cè)濃度,跑膠(因質(zhì)粒分子量一般較大,所以用低濃度的瓊脂糖膠和大的marker)

  以上就是關(guān)于離心機(jī)在質(zhì)粒DNA提取中的應(yīng)用總結(jié),如果您還想了解更多有關(guān)產(chǎn)品的應(yīng)用信息,可多多關(guān)注上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司。


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