實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)在蛋白表達(dá)系統(tǒng)中作用分析
蛋白表達(dá)的相關(guān)研究中可以看到離心機(jī)起到了重要作用。
體外重組蛋白表達(dá)有四大系統(tǒng)：大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)，酵母表達(dá)系統(tǒng)及昆蟲細(xì)胞表達(dá)。
今天我們要詳細(xì)講一下大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。
先從大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)步驟了解：
不包括基因構(gòu)建等上游操作和蛋白純化部分。基因構(gòu)建參考密碼子優(yōu)化，蛋白純化參考蛋白純化專題。以下內(nèi)容主要包括蛋白表達(dá)鑒定：
表達(dá)鑒定第一天的任務(wù)，常用抗性選擇根據(jù)感受態(tài)細(xì)胞選擇拿到質(zhì)粒，實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)離心（3000r/min；2min）在質(zhì)粒中加入TE（使質(zhì)粒最終加入到110μL感受態(tài)細(xì)胞中的量為80-100ng，據(jù)此確定加入TE的量），一般為（1μg質(zhì)粒加20μLTE；2μg質(zhì)粒加50μLTE；5μg質(zhì)粒加100μL TE）將質(zhì)粒與TE混勻，加入2μL混液于感受態(tài)細(xì)胞中將感受態(tài)細(xì)胞放入冰箱（4℃）中，30min取出后立即放入水浴鍋中（42℃），熱激90s,再次放入冰箱（4℃）中，3min拿出后取200μL的LB液體培養(yǎng)基加入到已轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的感受態(tài)細(xì)胞中放入搖床（37℃; 195r）中, 30nim至60min; （最佳45min）取出離心（3000r/min；2min）去掉200μL的上清，留100μL左右上清懸浮沉淀，吸取50μL懸液涂平板，（先將對(duì)應(yīng)抗性的平板放入培養(yǎng)箱（37℃）中預(yù)熱20min）把平板放入培養(yǎng)箱（37℃），過(guò)夜（12h至16h）。
其次是表達(dá)鑒定第二天的任務(wù),注意Pcold的表達(dá)溫度：
每個(gè)平板挑取單菌落至4支對(duì)應(yīng)抗性的L（4ml）試管中，編號(hào)為“0”“1”“2”“3”。
將試管放入搖床（37℃；195r）中，（單抗3h左右；雙抗4左右；剛開(kāi)始用可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)OD值；熟練后可目測(cè)（背光下，以試管中的槍頭為例，剛剛看不見(jiàn)槍頭即可）），測(cè)OD值（0.6至0.8）。
從“0”號(hào)管中取700μL懸液加入到100μL（C=80%）的保種甘油中，震勻，放入冰箱（-20℃）凍存。
在每組菌的“1”“2”“3”號(hào)試管中分別加入2μL的IPTG（終濃度0.5mM最適）。
視不同的載體選擇適合的表達(dá)環(huán)境（PET/PGEX：15℃表達(dá)過(guò)夜；25℃表達(dá)6h；37℃表達(dá)3h至4h（4支試管，“0”“1”號(hào)試管15℃表達(dá)過(guò)夜；“2”“3”試管37℃表達(dá)3h至4h）。Pcold：全部15℃表達(dá)過(guò)夜）。
最后是表達(dá)鑒定第三天，全菌的表達(dá)鑒定分析，注意控制溶質(zhì)的量及溶液黏度：
從每組4支的試管中均取500μL菌液加入到1.5ml離心管中，（若OD值不一樣，值小的可多取）離心（6000r/min），5min, 去上清，留沉淀（沉淀少的，可再取菌液離心，盡量使沉淀量接近）。
在每個(gè)離心管中加入500μL的DDH2O,懸浮沉淀，離心（6000r/min），5min, 去上清，留沉淀。
在每支離心管中加入45μL的1×PBS和45μL的2×Loading Buffer懸浮沉淀（當(dāng)溶質(zhì)適量且均一的情況下，加入量不變；當(dāng)溶質(zhì)多且粘稠時(shí)，應(yīng)使加入量增大，為降低粘度也可減少上液量）。
放入煮樣器（100℃） 25min。
取出后離心（6000r/min) 3min, 電泳檢測(cè)。
從上述詳細(xì)步驟可以看出實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)在整個(gè)過(guò)程中都不能缺席。
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